目的
观察骨形态发生蛋白(BMP) 、转化生长因子- β(TGF - β) 、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 在骨折修复中的表达及分布情况,进而探讨其作用机制。
方法
以成年雄性新西兰兔为研究对象,制作桡骨骨折愈合模型。伤后不同时期处死取材,分别进行组织学和BMP、TGF - β和bFGF 免疫组化染色观察。结果 (1) 伤后3 d 开始形成原始骨痂。1 周时肉芽组织中的间质细胞开始分化为软骨细胞,软骨形成后再进行软骨内化骨。4 周时形成连接骨折端的桥接骨痂。(2)伤后不同时期,血肿中炎性细胞表达bFGF。骨膜增殖细胞、骨端骨细胞以及原始骨痂成骨细胞表达TGF -β。肉芽组织中间质细胞、单核巨噬细胞和多核巨细胞表达TGF -β、bFGF。原始骨痂成骨细胞、骨端骨细胞和软骨细胞表达BMP。表达后BMP、TGF -β较均匀分布于软骨基质以及肉芽组织间质中,bFGF 主要分布于肉芽组织中非活跃的间质细胞周围。结论 BMP、TGF - β和bFGF 有着各自的表达和分布特点,并共同调解骨原细胞的增殖和成骨细胞、软骨细胞的分化,最终完成骨折修复。
骨折修复是一个复杂的骨再生过程,其组织学过程伴随着复杂的生物学调节机制。大量细胞因子在不同的骨折修复阶段发挥不同的作用,调控骨再生过程。既要保证骨原细胞(osteogenetic cell) 的来源和数量,又要使骨原细胞适时地转化为软骨细胞和成骨细胞,最终完成骨折修复[1 ] 。有关细胞因子的生物学效应的体外实验研究较多,而在原位的研究较少。笔者选择有代表性的细胞因子骨形态发生蛋白(BMP) 、转化生长因子- β(TGF - β) 、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) ,观察其在骨折修复中的表达及分布情况,进而探讨其作用机制。
材料与方法
1. 模型制作:实验对象为雄性成年新西兰兔,体重2. 0～3. 0 kg。常规手术方法,在一侧桡骨中段用线锯将骨干锯断,制作骨折愈合模型。
2. 动物分组:42 只兔,随机分为6 组,每组7 只,分别于伤后1 ,3 d ,1 ,2 ,3 ,4 周处死,将骨折端及周围组织一同取材。
3. 主要试剂:BMP 单克隆抗体(第四军医大学) ;TGF - β、bFGF 单克隆抗体和SP 试剂盒(Sigma 公司,美国) 。
4. 观察方法:取材后标本置入质量浓度为40 g/ L 的多聚甲醛固定24 h ,以质量浓度为200 g/ L 的乙二胺四乙酸( ED2TA) 脱钙1～3 周,石蜡切片厚8μm。分别进行常规HE 染色和BMP、TGF -β、bFGF 单克隆抗体的免疫组化染色。SP 方法单克隆抗体免疫组化染色:BMP 抗体工作浓度1∶300 ,TGF -β
抗体工作浓度1∶300 ,bFGF 抗体工作浓度1∶500。二氨基联苯胺(DAB) 方法显色, 阳性为棕色。对照以磷酸缓冲液(PBS) 代替I 抗。
结 果
1. 组织学观察:伤后1 d ,骨折局部充满血肿,骨端骨膜增厚,细胞增生。3 d 时血肿消失,骨膜反应形成原始骨痂,在骨痂外由周围组织向骨折处长入肉芽组织,其中含有大量间质细胞、单核巨噬细胞、多核巨细胞和血管。1 周时骨膜反应继续增加,骨内膜也有类似的骨膜反应。在肉芽组织中开始有软骨细胞形成。2 周时骨折端骨膜反应停止,骨痂不再增加。软骨组织迅速再生,骨折间隙内也有软骨形成。3 周时靠近骨端骨痂处的软骨细胞肥大,并开始出现软骨内骨化。4 周时软骨大部分已骨化,形成桥接骨痂(bridge callus) 。
2. 免疫组化观察:伤后1 d ,血肿以及血肿中炎性细胞bFGF 呈阳性染色。增生骨膜间质bFGF 呈阳性染色。此时,无BMP、TGF -β阳性染色。3 d 时增生骨膜细胞及骨膜间质TGF - β呈阳性染色。骨端骨细胞TGF -β呈阳性染色。肉芽组织中单核巨噬细胞、多核巨细胞以及间质细胞bFGF、TGF - β呈阳性染色。肉芽组织间质bFGF、TGF - β呈阳性染色。1 周时原始骨痂成骨细胞、骨端骨细胞BMP、TGF -β呈阳性染色,新形成的软骨基质BMP、TGF-β呈阳性染色。肉芽组织中单核巨噬细胞、多核巨细胞以及间质bFGF、TGF - β细胞继续呈阳性染色。肉芽组织间质BMP、TGF -β、bFGF 呈阳性染色,BMP、TGF -β肉芽组织中染色较均匀,bFGF 则主要在肉芽组织中不活跃的间质细胞周围呈阳性染色。2 周时除上述阳性细胞外,新形成的软骨细胞开始出现BMP、TGF -β阳性染色,软骨基质也呈阳性染色。此后,单核巨噬细胞、多核巨噬细胞以及间质细胞明显减少,肥大成熟软骨细胞未见BMP、TGF - β
阳性染色。幼稚软骨细胞、骨痂表面成骨细胞BMP、TGF -β继续呈阳性染色。
讨 论
骨折修复为骨组织完全性再生,而非纤维瘢痕修复。其修复的组织学过程包括血肿、炎症、骨膜反应、软骨形成、软骨内成骨、骨改塑等阶段。本实验
的组织学观察与上述组织学过程完全相同。伤后1 d时即可见骨膜增生反应,并在3 d 后开始形成原始骨痂,但这种骨痂生长到一定程度即停止,不能连
接骨折端。由周围组织伴随血管长入肉芽组织中的间质细胞,1 周时开始分化为软骨内细胞,软骨形成后2 周时进行软骨内化骨,最终形成连接骨折端的
桥接骨痂。
骨折修复是一个复杂的骨再生过程,其组织学过程伴随着复杂的生物学调节机制,大量细胞因子在不同的骨折修复阶段发挥不同的作用。BMP 对骨原细胞的分化起主要的决定性作用,没有BMP 的参与,再生的组织只能是结缔组织[2 ] 。其他大量细胞因子也参与调控骨原细胞的增殖和成熟等过程。按照Goldring 等[3 ]的分类,这些细胞因子分为两类,一类是局部产生的内源性细胞因子(endogeneouslyproduced cytokines) ,它们以“旁分泌”和“自分泌”的形式作用于自身和邻近细胞;另一类是远距离细胞产生的外源性细胞因子( exogeneously produced cy2tokines) ,以“内分泌”形式作用于骨再生局部的细胞。前者包括TGF -β、骨源性生长因子(BDGF) 、软骨源性生长因子(CDGF) 等,其主要功能是使软骨-骨原细胞分化成熟,转化为软骨细胞和成骨细胞,并促进骨基质蛋白的合成,加速软骨内化骨过程。后者包括成纤维细胞生长因子( FGF) 、表皮生长因子(EGF) 、血小板衍生生长因子(PDGF) 等丝裂素(mito2gen) ,其主要功能与各种组织细胞分裂、增殖有关,但不能促进骨基质蛋白的合成。笔者正是在上述理论的前提下,选择了有代表性的细胞因子BMP、TGF-β、bFGF , 观察其在骨折修复中的表达和分布规律。
bFGF 对软骨细胞既是丝裂素,又是形态发生因子,培养的软骨细胞在bFGF 的作用下,才能保持其分化状态,否则很快变为成纤维样细胞[4 ] 。亦即bFGF 对维持软骨细胞的表型也发挥着重要作用。
TGF -β从两个方面影响软骨形成,一是促使间质细胞向软骨细胞分化[5 ,6 ] ;另一方面是通过促使软骨细胞成熟来刺激软骨基质的合成[7 ,8 ] ,增加软骨的
形成。可见TGF - β既是丝裂素,又是很好的助形态发生因子。BMP 是决定间质细胞向软骨细胞分化的决定性因素。有关细胞因子的成骨诱导作用大多为体外实验所发现,而体内原位的研究不多。笔者旨在通过观察BMP、TGF - β、bFGF 在骨折修复中的表达和分布,进而探讨其在骨折修复中的作用机制。
本实验中发现3 种细胞因子有着各自的表达顺序和分布规律。首先,最早在(伤后1 d) 血肿中炎性细胞表达bFGF ,并分布于骨膜中,此时骨膜出现细胞增殖。3 d 后骨膜增殖细胞以及骨端骨细胞开始表达TGF -β,肉芽组织中间质细胞、单核巨噬细胞、多核巨细胞开始表达TGF - β、bFGF ,合成后分布于
骨膜、肉芽组织间质中。至伤后1 周时,才发现原始骨痂成骨细胞、骨端骨细胞表达BMP ,同时也继续表达TGF -β。肉芽组织中单核巨噬细胞、多核巨细
胞以及间质细胞继续表达bFGF、TGF -β。3 种因子表达后均分布于新形成的软骨基质以及肉芽组织间质中,BMP、TGF -β分布较均匀。bFGF 主要分布于
肉芽组织中非活跃的间质细胞周围。2 周时新形成的软骨细胞开始表达BMP、TGF - β。此后,幼稚软骨细胞、骨痂表面成骨细胞继续表达BMP、TGF -β。结果表明BMP、TGF - β、bFGF 分别由不同细胞在不同的时间表达,表达后其分布也不完全相同。在表达与分布的同时,也伴随着不同的组织学变化。结合BMP、TGF -β、bFGF 的表达时间、表达细胞以及表达后的分布情况,笔者认为,bFGF 的主要作用是促使各种细胞分裂、增殖,表现在骨折修复早期能够促进骨膜细胞周围间质细胞增殖,并促进肉芽组织形成,之后,促使肉芽组织中间质细胞不断分裂增殖;TGF -β的作用是促进各种细胞成熟,如促进骨膜细
胞成熟,进而形成原始骨痂,并能协助BMP 促进间质细胞向软骨细胞分化;BMP 的表达才使得间质细胞分化为软骨细胞,导致软骨形成,进而软骨内化骨,形成桥接骨痂连接骨折端。由此,笔者认为,上述细胞因子调控骨再生过程,既保证了骨原细胞的来源和数量,又能使骨原细胞适时地转化为软骨细胞和成骨细胞,最终完成骨折修复。当然,细胞因子的作用是复杂的,并且多因子相互作用,因而仍需进行大量的实验研究。
参 考 文 献
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