目的 研究长管骨引导性骨再生成骨细胞来源,进一步完善引导性骨再生理论。
方法 将42 只成年雄性新西兰兔在双侧桡骨中段制作标准骨缺损不愈合模型,用硅胶膜呈管状包裹一侧骨缺损,另一侧作为对照侧。12 只兔术后1～12 周分别于每周进行X线检查;30 只兔,随机分为6组,分别于术后3 天、1、2、3、4、5 周处死取材,分别进行常规HE 染色,SP 方法BMP、BGP 抗体的免疫组
化染色。
结果 隔膜在骨缺损局部生成隔离密闭的腔室,将周围组织阻挡于骨缺损之外,早期骨端骨内膜、骨髓基质细胞大量增殖,形成肉芽组织占据骨缺损。骨再生过程中表现出明显的组织学特征:骨痂表面为2～3 层成骨细胞,骨缺损中央为肉芽组织,两者之间为数层细胞形成的移行区,细胞排列疏松,基质较多。早期骨端骨内膜、骨髓基质细胞BMP、BGP 呈强阳性染色,骨痂生长过程中,移行区部分细胞呈阳性染色。 结论 引导性骨再生成骨细胞在早期来源于髓内的骨内膜和骨髓基质;骨痂形成后,成骨细胞则来源于骨内膜、骨髓、骨膜增殖细胞共同形成的肉芽组织中的间质细胞和成纤维细胞。
研究表明,引导性骨再生能够明显提高骨再生的能力,修复大段动物长管骨缺损[1 ] 。在其成功机制中,成骨细胞来源是一个重要因素,也是一个有待于进一步研究的问题。本实验旨在观察引导性骨再生的成骨细胞来源,以期进一步完善引导性骨再生理论。
材料与方法
1. 模型制作:42 只成年雄性新西兰兔,体重210～310 kg。连同骨膜截除其桡骨中段10 mm ,制作标准骨缺损不愈合模型;随机选择一侧骨缺损为实验
侧,用硅胶膜呈管状包裹骨缺损,制成引导性骨再生模型,另一侧不做特殊处理作为对照侧[2 ] 。
2. 主要试剂:骨形态发生蛋白(BMP) 单克隆抗体(第四军医大学提供) ,骨钙素(BGP) 多克隆抗体(解放军总医院生化实验室提供) 。
3. 动物分组及观察方法:12 只兔术后1～12 周分别于每周拍摄X 线片;30 只兔随机分为6 组,每组5 只,分别于术后3 天、1、2、3、4、5 周处死取材,标本用4 %多聚甲醛固定24 小时,20 %EDTA 脱钙1～3 周,石蜡切片(切片厚度7μm) ,分别进行常规HE染色、SP 方法BMP、BGP 抗体的免疫组化染色,BMP抗体及BGP 抗体工作浓度均为1 :300 ,DAB 方法显色,阳性为棕色显色,对照以PBS 代替一抗。
结 果
1. X线观察:实验侧术后1 周即开始在两侧骨折端形成骨痂,呈锥形进行性生长,12 周时12 只动物愈合8 例;对照侧早期也有骨痂生长,4 周后骨痂生长停止,12 周时无1 例愈合[3 ] 。
2. 大体观察: (1) 实验侧:1 周时隔膜管外覆盖一层“骨膜”样软组织,两侧与骨膜连续,隔膜管完整,维持骨缺损空间; 2 周时两骨端已被软组织连接,呈纺锤形,中央较细;4 周时隔膜管内已形成丰富的软组织连接两骨端,填充骨缺损。(2) 对照侧:1周时即见周围软组织长入、填充骨缺损,骨膜被周围软组织阻断,不能通过骨缺损。
3. 镜下观察:实验侧3 天时隔膜内呈血肿样改变,1 周时骨内膜细胞、骨髓间质细胞以及隔膜下的骨膜细胞增生活跃,骨髓腔内形成大量骨痂,并向骨
缺损中央延伸,同时上述增殖细胞向血肿内生长(图1) ;2 周时上述增殖细胞伴随血管长入血肿,血肿机化,形成肉芽组织,并与对侧肉芽连接。肉芽中包括
多种组织细胞:间质细胞、单核巨细胞、多核巨噬细胞、成纤维细胞等(图2) ;3 周后肉芽组织大量增生,随着骨痂生长,表现出明显的组织学特征:骨痂表面
为2～3 层成骨细胞,中央为肉芽组织,两者之间为数层细胞形成的移行区,细胞排列疏松,基质较多(图3) ;5 周时缺损内细胞仍然保持增殖活跃状态,不断产生骨痂。对照侧早期骨痂的形成为软骨内成骨过程,4 周以后不再有新的软骨形成,同时已形成的软骨出现退变,最终在骨缺损内形成纤维结缔组织[3 ] 。
4. 免疫组化染色:实验侧3 天时未见BMP、BGP阳性骨缺损。镜下组织学发现早期骨内膜、骨髓间质及骨髓血管内皮细胞大量增殖,并形成编织骨痂,同时骨端骨膜也大量增殖,与上述增殖细胞一起长入远端的血肿,共同形成肉芽组织,并与对侧肉芽组织连接,填充骨缺损。此后肉芽组织中靠近骨痂的间质
细胞、成纤维细胞不断分化为成骨细胞,不断产生新骨,最终使骨缺损骨性愈合。但是,就本实验使用的技术方法,尚难确定骨髓、骨内膜和骨膜中哪一种细
胞成份所占成骨比例的多少。BGP 是目前唯一的成骨细胞特异性标记物,并且种属之间有着较高的交叉免疫性,种属特异性差[9 ,10 ] 。BMP 也是成骨细胞标记物之一。实验中我们观察到早期增殖的骨膜、骨内膜及骨髓间质细胞即呈BGP、BMP 强阳性表达,同时伴随编织骨的形成,说明此时的成骨细胞已完全成熟具备成骨能力。由上述组织增殖共同形成的肉芽组织细胞却是阴性,但在肉芽组织与编织骨痂表面阳性成骨细胞之间的移行区域,确有部分细胞BGP 和BMP 染色阳性,说明移行区细胞已具备部分成骨细胞特性,是前成骨细胞,由肉芽组织细胞分化而来,伴随骨痂的生长,逐渐成熟进而不断产生新骨,证实了组织学观察的结果。因此,本实验骨再生的组织来源早期为髓内的骨内膜和骨髓基质,骨膜发挥的作用较小。这一结果与以往实验大致相同[2 ] 。在早期骨痂形成的染色细胞,1 周后骨端增生的骨膜、骨内膜、骨髓间质细胞呈BMP、BGP 强阳性染色(图4) ;3 周后伴随骨痂生长,骨痂表面成骨细胞呈BMP、BGP 阳性染色,移行区部分细胞呈阳性染色,肉芽中组织细胞均为阴性(图5)。
讨 论
骨折修复的实质是骨原细胞(osteogenic cells) 的聚集、增殖和分化为成骨细胞,继之成熟的成骨细胞分泌骨基质、矿化,其中任何一个环节的异常,都将阻断正常的骨再生过程。骨原细胞至少有3 个来源:骨膜(包括骨内膜) 、骨髓及周围肌肉的间质组织。而且骨折周围肌肉间质组织中伴随血管长入的
骨原细胞,直接形成桥接骨痂,对骨折修复发挥重要作用[4 ] 。从组织来源这一点分析,引导性骨再生恰恰将周围骨原细胞隔离于骨缺损外。由于再生组织
的来源减少,其再生的能力应当减弱,从理论上来讲,引导性骨再生更难修复骨缺损。但是,引导性骨再生成功的事实,提示我们应当从更深入的角度去
认识引导性骨再生。
早在70 年代,Freidenstein [5] 就提出了确定性骨原细胞(determined osteoprogenetic cell ,DOPC) 和诱导性骨原细胞(inductive osteoprogenetic cell ,IOPC) 理论,此后Freidenstein 和Owen 进行了较系统的研究,对完善和发展这一理论做出了重要贡献。骨组织中包括基质细胞系统和造血细胞系统,基质组织包括骨膜、骨内膜中的成骨细胞和前成骨细胞以及血管和骨中腔隙被衬的网状细胞和内皮细胞;骨髓中的基质细胞形成造血细胞的支架,并与骨内膜、Harvarsian管以及骨外膜相延续[6 ,7 ] 。上述两种基质细胞经培养后,均可在异位自主形成骨组织,而无需诱导物质。在上述研究的基础上,Owen 和Freidenstein[8 ]提出了骨髓中的基质细胞与其它基质细胞有着共同的干细胞,而不是造血干细胞,从而确定了上述两类基质细胞有着共同的来源,同属DOPC ,可自主成骨。而骨外其它组织成纤维细胞在使用相同条件下不能成骨,只有在与膀胱移行上皮或脱钙骨基质、BMP共同存在时,才能形成骨组织,属IOPC[5 ] 。
长管骨引导性骨再生使用隔膜将其周围组织隔离,这样就将周围组织来源的具有分化能力的间质细胞排除在骨再生环境之外。在隔膜管内,骨内膜
细胞以及骨髓基质细胞首先增殖形成肉芽组织,其中增殖的细胞仍是DOPC ,而非IOPC。因此,其成功的骨再生来源只能是DOPC。在本实验中我们观察
到,3～7 天由骨膜增生的组织就将隔膜管完全封闭,因此也就与外界完全隔离,使周围组织无法进入同时,增殖的骨内膜细胞、骨髓基质细胞、骨膜细胞
共同长入骨缺损,开成肉芽组织,其中具有分化能力的间质细胞或成纤维细胞是后期成骨细胞的来源,两者不断向成骨细胞分化,在骨痂表面不断成骨,使
骨痂延伸。
参 考 文 献
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3 张永刚,卢世璧,王继芳,等. 利用隔膜技术探讨骨折不愈合原因. 中华骨科杂志,1998 ,18 :6782681.
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引导性骨再生中成骨细胞来源的实验观察图
图1 1 周时实验侧骨端骨内膜(白箭头示) 、骨髓间质细胞(黑箭头
示) 增生活跃,骨髓腔内生成大量骨痂 HE ×20 图2 2 周时实验
侧骨端增殖细胞伴随血管长入血肿,血肿机化,形成肉芽组织,肉芽
中包括各种组织细胞:间质细胞(黑箭头示) 、单核巨细胞(篮箭头
示) 、多核巨噬细胞(红箭头示) 等 HE ×20 图3 3 周后随着骨痂
生长,实验侧表现出明显的组织学特征:骨痂表面为2～3 层成骨细
胞(黑箭头示) ,中央为肉芽组织(白箭头示) ,两者之间为数层细胞
形成的移行区,细胞排列疏松,基质较多(蓝箭头示) HE ×20 图4
1 周后实验侧骨端增生骨内膜(黑箭头示) 、骨髓间质细胞(白箭头
示) 呈BMP、BGP 强阳性染色 SP ×20 图5 3 周后伴随骨痂生长,
实验侧骨痂表面成骨细胞(黑箭头示) 呈BMP、BGP 阳性染色,移行
区部分细胞(白箭头示) 呈阳性染色 SP ×40
